Was ist in-situ-hybridisierung?

In-situ-Hybridisierung (ISH)

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine molekularbiologische Technik, die verwendet wird, um spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen in Zellen oder Geweben direkt zu lokalisieren. Der Begriff "in situ" bedeutet "am Ort", was darauf hindeutet, dass die Hybridisierung direkt am untersuchten Gewebe oder Zellpräparat erfolgt, anstatt die Nukleinsäuren zu extrahieren und separat zu analysieren.

Prinzip:

Das Grundprinzip der ISH beruht auf der komplementären Basenpaarung zwischen einer Sonde (einer markierten DNA- oder RNA-Sequenz) und der Ziel-Nukleinsäuresequenz im Gewebe oder in den Zellen. Die Sonde ist so konstruiert, dass sie komplementär zu der Sequenz ist, die man detektieren möchte. Nach der Hybridisierung wird die Sonde detektiert, und dadurch kann die Lokalisation der Zielsequenz visualisiert werden.

Schritte:

1. Präparation des Gewebes/Zellen: Das Gewebe oder die Zellen werden auf einem Objektträger fixiert und behandelt, um die Ziel-Nukleinsäuren für die Hybridisierung zugänglich zu machen.
2. Sondenpräparation: Spezifische DNA- oder RNA-[<a href="https://de.wikiwhat.page/kavramlar/Sonden">Sonden</a>] werden synthetisiert und markiert. Die Markierung kann mit radioaktiven Isotopen, Fluoreszenzfarbstoffen (FISH) oder Enzymen erfolgen.
3. Hybridisierung: Die markierte Sonde wird mit dem präparierten Gewebe/Zellen inkubiert. Unter geeigneten Bedingungen hybridisiert die Sonde mit der komplementären Zielsequenz.
4. Waschen: Überschüssige, nicht-hybridisierte Sonde wird durch Waschen entfernt.
5. Detektion: Die hybridisierte Sonde wird detektiert, entweder durch Autoradiographie (bei radioaktiven Sonden), Fluoreszenzmikroskopie (bei Fluoreszenzsonden) oder enzymatische Reaktionen (bei enzymmarkierten Sonden).
6. Visualisierung: Die Lokalisation der Zielsequenz wird unter dem Mikroskop sichtbar gemacht.

Anwendungen:

• Genexpressionsanalyse: Bestimmung der Lokalisation und des Expressionsmusters von Genen in Geweben.
• Nachweis von Virusinfektionen: Identifizierung von viralen Nukleinsäuren in infizierten Zellen.
• Chromosomenanalyse (FISH): Visualisierung von Chromosomenstrukturen und Detektion von Chromosomenaberrationen (z.B. Translokationen, Deletionen, Duplikationen). Siehe auch [<a href="https://de.wikiwhat.page/kavramlar/Fluoreszenz%20in%20situ%20Hybridisierung">Fluoreszenz in situ Hybridisierung</a>] (FISH).
• Tumordiagnostik: Identifizierung von spezifischen Genveränderungen in Tumorzellen.
• Entwicklungsbiologie: Studium der Genexpression während der Embryonalentwicklung.

Varianten:

• FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung): Verwendet Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung der Sonden.
• CISH (Chromogene In-situ-Hybridisierung): Verwendet enzymatische Reaktionen zur Detektion der Sonden, wobei ein chromogener Farbstoff erzeugt wird, der unter einem herkömmlichen Lichtmikroskop sichtbar ist.
• RNA ISH: Spezifisch für den Nachweis von RNA-Molekülen.

Vorteile:

• Ermöglicht die direkte Visualisierung der Genexpression oder des Vorhandenseins spezifischer Nukleinsäuresequenzen in ihrem natürlichen Kontext (Zelle/Gewebe).
• Bietet räumliche Information über die Verteilung der Zielsequenz.
• Kann an fixierten Gewebeproben durchgeführt werden.

Nachteile:

• Kann zeitaufwendig sein.
• Die Empfindlichkeit kann begrenzt sein.
• Die Interpretation der Ergebnisse kann subjektiv sein.